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實例解析Western Blot應(yīng)用

目標蛋白定性分析

本文通過傳染性腸胃炎病毒（TGEV）感染豬睪丸細胞后的蛋白組學變化，發(fā)現(xiàn)23種蛋白上調(diào)，10種蛋白下調(diào)（圖A），并用WB鑒定角質(zhì)蛋白19（keratin 19）、a-微管蛋白（a- tubulin）和抗增殖蛋白（prohibitin）（圖B）參與了病毒的感染過程，表明該病毒感染與細胞結(jié)構(gòu)完整性、囊泡運輸及RNA處理、蛋白合成調(diào)控等有關(guān)。

目標蛋白定量/半定量分析

文中利用WB對目標蛋白進行了半定量研究。在這篇文章中，Rijn等通過WB方法發(fā)現(xiàn)先天性腹瀉（CDD）病人及其父母DGAT1蛋白表達缺失。作者通過DNA測序分析了DGAT基因，確定了DGAT1基因五個新的純合變異體，其RT-PCR發(fā)現(xiàn)cDNA異常切割，因此DGAT蛋白無表達。這造成細胞脂代謝異常。文章通過基因敲除法構(gòu)建了DGAT1缺失型類小腸器官，還在Caco-2細胞系中重組表達了DGAT1和DGAT2，目的是體外模擬DGAT蛋白缺失及重建后對脂代謝的影響。類小腸器官及細胞系中DGAT蛋白的表達都是通過WB方法得以確定的。該實驗證實，敲除DGAT1蛋白造成脂代謝紊亂，對細胞造成脂毒性，重建DGAT1或DGAT2可恢復(fù)脂代謝。

目標蛋白構(gòu)象結(jié)合功能分析

案例Ⅰ

泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)對于錯誤蛋白降解具有重要意義。左圖顯示Nrf2蛋白在泛素連接酶作用時間延長后，泛素化程度逐漸增加。若將各時間點的Nrf2蛋白結(jié)構(gòu)解析，即可將該蛋白的結(jié)構(gòu)研究與功能研究相結(jié)合。在Virology的這篇文獻中，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132和lactacystin可顯著降低豬II型圓環(huán)病毒（PCV2）早期感染的滴度，并通過對泛素基因的沉默實驗，發(fā)現(xiàn)其也顯著降低PCV2滴度，由此推斷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是PCV2的早期復(fù)制所必須的。

案例Ⅱ

硝基化促使a-突觸核蛋白（a-synuclein）寡聚，以及寡聚化的a-synuclein促使人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞SH-SY5Y凋亡，并呈時間劑量效應(yīng)的研究。WB結(jié)果顯示硝基化程度加深，a-synuclein呈現(xiàn)了二聚及多聚特性。硝基化的a-synuclein激活了iNOS并抑制了FAK，這兩條信號可能都參與了促SH-SY5Y凋亡作用。作者還發(fā)現(xiàn)integrin抗體部分抑制了細胞凋亡，將已有的integrin/FAK/caspase 3信號通路改變?yōu)閕ntegrin-iNOS/-FAK/caspase 3信號通路。

磷酸化信號分析

案例Ⅰ

Cai等在JBC上發(fā)表的文章，揭示了微小RNA在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-17/20a靶向抑制p53的核心激酶DAPK3（死亡相關(guān)蛋白激酶3）的表達，去除這些微小RNA將導(dǎo)致依賴于p53的微小RNA轉(zhuǎn)錄抑制被去除，從而形成一個正反饋環(huán)，促進腫瘤形成，它們被稱為原癌微小RNA（oncomiRs）。C圖清楚顯示了當對Hela細胞轉(zhuǎn)入miR-17、miR-20a或miR-17/20a拮抗劑后，DAPK3蛋白表達增加，雙鏈DNA不穩(wěn)定性的標志物ATM（Ser-1981）、p53BP1（Ser-25/29）蛋白絲氨酸磷酸化程度增高，而各自總蛋白水平并沒有變化。D圖進一步確認了這些磷酸化水平升高是由DAPK3表達量升高引起的。p53磷酸化水平升高將導(dǎo)致其抑制原癌微小RNA轉(zhuǎn)錄的水平下降，進一步提高DAPK3激酶的表達。該研究補充了原有的通過E2F家族蛋白激活miR-17/20a的負反饋調(diào)節(jié)通路。

案例Ⅱ

糖尿病代謝紊亂可能會增加阿爾茨海默癥（AD?。╋L險，其病理機制是導(dǎo)致Ab和tau蛋白表達量的增加。在Clin Interv Aging雜志的文章中，作者發(fā)現(xiàn)四環(huán)素衍生藥物二甲胺四環(huán)素可降低糖尿病模型大鼠的Ab蛋白表達，tau蛋白磷酸化及炎癥因子如IL-1b等的表達。證實該藥物是通過抑制糖尿病代謝紊亂所引起的炎癥反應(yīng)而淀粉樣前體的形成。WB結(jié)果顯示，藥物處理前后總tau蛋白并無變化，但神經(jīng)元內(nèi)斑塊標志物T231和S214磷酸化tau的磷酸化程度明顯降低，胞間斑塊標志物PHD指形蛋白1（PHF-1）的磷酸化也明顯降低。

標簽抗體的靈活運用

案例Ⅰ

Radics等在脂膜上設(shè)計了精巧的針形通道，模擬在細菌膜上的3型分泌系統(tǒng)（注射體，"injectisomes"），研究注射體的結(jié)構(gòu)及工作原理。作者通過設(shè)計目標蛋白SptP(WT)及其FLAG和GFP標簽融合蛋白，F(xiàn)LAG標簽可用于示蹤蛋白在胞內(nèi)和胞外的分布。由于帶有GFP標簽的融合蛋白不能通過該通道，GFP標簽起到了使SptP形成蛋白-通道復(fù)合體的作用，可用冷凍電鏡解析復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。利用金標抗GFP抗體可在電鏡下顯示復(fù)合體的形成。

案例Ⅱ

本文利用標簽蛋白研究蛋白的功能區(qū)。Yang等在研究單純皰疹病毒（HSV）出芽復(fù)合體的形成機制時，設(shè)想病毒蛋白pUL31的C端25個Aa對于其結(jié)合衣殼蛋白及核蛋白形成核出芽復(fù)合體（NEC）非常重要，于是設(shè)計帶有HA標簽的pUL31蛋白31HA，缺少C端25個Aa的31HA/560S，以及缺少pUL25區(qū)的31HA/25 null，發(fā)現(xiàn)pUL31及缺少pUL25的pUL31可以結(jié)合衣殼蛋白，但缺少C端25個Aa的31HA/560S不能結(jié)合。利用金標記HA抗體可在電鏡下觀察到衣殼蛋白頂端與pUL31形成復(fù)合體的情形。