在FCM檢測中，所有細胞均會產生非特異性熒光，最終結果是細胞自身非特異性熒光與特異性結合熒光的疊加效果。為排除干擾、確保結果可靠，需設置陰性對照——這是一類對照的統稱，核心目的是“確定陰性基準、排除假陽性"，根據干擾來源不同可分為空白對照、陰性細胞對照、同型對照等類型，其中空白對照是最基礎的類型，各類對照的具體功能與邊界如下：

1.1空白對照：排除“檢測系統"相關假陽性

空白對照指未添加任何熒光染色試劑的樣本（如僅含細胞和緩沖液的樣本），主要針對“檢測系統本身"的干擾，核心作用包括：

確定陰性細胞群的基礎位置，同時輔助判斷細胞大小、顆粒度等固有參數。

區分細胞的本底自發熒光與實驗過程引入的非特異性熒光（如試劑殘留、操作污染及儀器本底熒光等）。

調節儀器電壓參數，使陰性細胞信號處于各通道合適區間，避免電壓過低導致“壓線"或過高導致信號溢出。

直觀呈現細胞的本底信號水平，便于后續圈門分析時直接排除非特異性信號群體。

1.2陰性細胞對照：排除“細胞自身特性"相關假陽性

陰性細胞對照指已知不表達目標抗原的細胞樣本，包括未受目標抗原刺激或自然狀態下不表達該抗原或經過基因敲除的細胞（如明確不表達CD3的HEK293細胞），主要針對“細胞自身特性"的干擾，核心作用包括：

排除特定細胞系因表面結構、高自發熒光等固有特性導致的假陽性。

驗證檢測體系對“明確陰性細胞"的識別能力，確保實驗體系的特異性。

適用于新細胞樣本或未知抗原表達情況的檢測場景，作為陽性結果的“陰性基準"。

1.3同型對照：排除“樣本-抗體結合"相關假陽性

同型對照指用與特異性抗體同亞型、同熒光素的無關抗體染色的樣本，主要針對“抗體非特異性結合"的干擾，詳見“同型對照"章節。

3.1空白對照的正常信號標準：參數調節合適后，各檢測通道的陽性信號占比應低于0.5%；若細胞自發熒光較強，僅靠補償調節難以消除，需結合實驗優化（如更換熒光素、調整樣本處理方式）。

3.2對照選擇原則：單一對照無法覆蓋所有干擾，需根據實驗目的組合使用（如常規抗體染色實驗，需同時設置空白對照和同型對照）。

3.3局限性明確：空白對照不能替代同型對照/陰性細胞對照，因空白對照未涉及抗體結合、細胞特性等干擾，無法界定陽性門或排除細胞自身相關假陽。

這里對同型對照（Isotype Control）的意義做進一步闡明。

流式抗體通過Fab端與靶標進行特異性結合。但白細胞（除T細胞外）表面大多表達CD16、CD32、CD64等Fc受體，這些受體可與各種抗體的Fc端非特異性結合，出現非特異性染色，其中以單核細胞和巨噬細胞尤甚。此外，在活細胞的表面染色實驗中，單核細胞和巨噬細胞均存在吞噬抗體的現象。在多色流式實驗中，還存在熒光背景的影響及藥物處理的影響，即便對Fc受體進行了封閉，在分群不好的情況下，依然需要用到同型對照。

同型對照是用于消除抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色，由與一抗具有相同種屬來源、免疫球蛋白亞型、亞鏈和熒光標記方式的非特異性免疫球蛋白構成。與一抗保持相同的熒光染料-蛋白比值，以準確設定陰陽性閾值。其原理是通過匹配一抗的Fc區特征，阻斷Fc受體或補體介導的非特異性結合，從而驗證抗體結合的特異性。如果沒有適合的同型對照，在保持種屬來源、熒光標記方式、免疫球蛋白類別相同的條件下，優先選擇的順序應該是類別相同→亞型相同→亞鏈不同。

實驗時，如果僅僅參照陰性對照來圈門，就可能出現一部分假陽性結果。如果參考同型對照來區分陰陽性，就能夠把這部分非特異性結合造成的假陽性排除。但同型對照只能作為一種參考，不能直接以此為依據來確定陽性陰性分界點，或以此圈門。因為同型對照只能反映非特異性結合的背景熒光，不能排除其他相關影響因素。

造成非特異性染色的原因有多種，同型對照可以指示實驗步驟是否需要進一步優化。如果是由于細胞未封閉，同型對照與Fc受體結合，則應該優化封閉條件。如果是由于死細胞的存在，則需要同型對照與活死細胞染料聯合使用。

1.排除抗體因電荷、結構等特性與細胞表面非特異性結合產生的假陽信號。

2.精準界定染色樣本的陽性門位置，這是空白對照無法實現的功能，因為空白對照未涉及抗體結合過程。

3.驗證陽性信號是否來自特異性的抗原-抗體結合，尤其適用于弱表達抗原的檢測場景。

1.對于陰陽性分群明顯的指標，不需要同型對照即可設門，例如CD3、CD4、CD8等用于T細胞的檢測指標。對于陰陽性分群不清楚的指標，例如CD25、CD69、CD38等活化指標，及IFN-γ、IL-4、IL17A等細胞因子，則需要設置同型對照。

2.在某些特殊情況下，如單核細胞被PE/Cy7、APC/Cy7等串聯染料標記的抗體染色時，因為單核細胞一般傾向于與Cy7等染料非特異性結合，使用同型對照有助于獲得理想結果。

3.不清楚抗原表達情況的時候，一定要使用同型對照來界定陰性細胞群。

4.胞內染色時，因為胞內指標表達量一般不會太高，胞內染色過程也非常容易導致抗原抗體非特異性結合。

1.購買同一廠家的流式抗體和同型對照，不同廠家的熒光染料和抗體結合的比率可能是不同的。

2.流式抗體和同型對照的使用劑量和濃度需保持一致。

3.細胞非特異性熒光的強弱由細胞本身所決定，與細胞的體積大小有關，一般細胞體積越大，其非特異性熒光就越強；體積越小，其非特異性熒光就越弱。分析每一種細胞時，都需要設定這種細胞的同型對照，不能用一種細胞的同型對照值分析另外一種細胞，尤其是在體積相差較大時。

4.在進行多色流式實驗時，熒光滲漏對結果的影響較為明顯，同型對照無法反映出其它通道滲漏的熒光背景。這時就需要通過同型對照與熒光減一對照（Fluorescence Minus One, FMO）的聯合使用，即減一對照與被去掉的抗體對應的同型對照抗體的組合對照，消除熒光溢漏和非特異性結合造成的影響。